由CRISPR-Cas系统引起的基因组编辑革命浪潮中，CRISPR-Cas9系统及其衍生的精准编辑工具（包括碱基编辑和引导编辑）因其简单高效的特点，极大地加速了作物遗传育种的进程。基因组编辑工具在作物基因组工程上的应用通常依赖于农杆菌介导的遗传转化，该过程受到作物品种以及植物组织培养条件的诸多限制。因此通过植物病毒载体递送基因组编辑工具，绕过组织培养直接获得基因组编辑过的植株受到越来越多的关注。由于植物病毒自身的载荷限制，常规的CRISPR-Cas系统(Cas9和Cas12a)恐难以胜任，科研人员迫切需要体积紧凑且高效的CRISPR-Cas系统和相关衍生工具。包括Cas12f (Cas14, 400-700aa)和CasΦ (Cas12j, 700-800aa)在内的多种小型Cas效应蛋白被挖掘并开发成基因组编辑工具。尽管前人的研究证实了CRISPR-Cas12j在水稻中的编辑活性，但整体效率仍然偏低，并且尚未对其递送潜力进行进一步的探索。近日，万建民院士团队开发了高效可拆分的CRISPR-Cas12j2基因组编辑工具，提高了其在水稻中的编辑效率，并展示了Cas蛋白拆分策略未来用于开发新型递送技术方面的潜力。
作物高效小型化CRISPR-Cas基因组编辑系统开发
研究者首先通过crRNA的茎环结构优化筛选出了综合效率最优且最为保守的Cas12j2crRNA-TACG茎环变体，Cas12j2使用该crRNA变体产生的整体效率相比于原始crRNA获得了2倍的提升。随后研究者通过实验证实了Cas12j2对于孵育温度的敏感性。研究者进一步优化了Cas12j2系统的表达，通过单转录本STU（Single Transcript Unit）协调Cas12j2蛋白和相关crRNA的表达，以此为基础结合高效crRNA变体和最优spacer长度（18nt）创制的Cas12j2-STU.v2，在大幅提高Cas12j2的编辑效率的同时，也大大缩减了表达盒的体积并且简化了相关载体的构建流程。相比于前人常用双启动子分别驱动Cas蛋白和核酶介导crRNA加工的形式，无论是单靶点编辑还是多靶点编辑，STU表达形式都显示出了约5倍的编辑效率提升。Cas12j2-STU.v2在再生水稻植株中的编辑效率高达78.8%，该结果相比之前的研究报道有显著的提高。在Cas12j2-STU.v2基础上引入高效Cas12j2变体（nCas12j2）创制的Cas12j2-STU.v4，在部分编辑位点上又获得了1.2到2.4倍的编辑效率提升。进一步通过蛋白结构分析，在Cas12j2蛋白的RecⅡ柔性区域引入拆分位点，将其分成两个组分。两组分通过内含肽完成在细胞内的“顺式”剪接，其中在S511拆分位点，拆分后的Cas12j2在水稻原生质体中获得了与未拆分形式相当的编辑效率，为未来通过病毒载体传递完整的CRISPR-Cas系统奠定了技术基础。
该研究成果于2024年03月14日在线发表于植物学知名期刊Plant Communications （DOI:https://doi.org/10.1016/j.xplc. 2024.100881）。南京农业大学在读博士生孙岩、胡健健和在读硕士生胡智超为本文共同第一作者，万建民院士和李超教授为共同通讯作者。南京农业大学刘裕强教授、周时荣教授和西北农林科技大学李停栋教授等也参与了部分研究工作。该研究得到农业农村部、江苏省自然科学基金、江苏省前沿引领技术基础研究专项、海南省种业实验室和生物育种钟山实验室等项目资助。