大丽轮枝菌引起的黄萎病是棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一，严重影响棉花的产量和品质。探究棉花应答黄萎病菌的分子机制，发掘抗病基因并育种利用是提高棉花黄萎病抗性的最直接和有效的策略。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径“MAPKKK-MAPKK-MAPK”已被证明在植物响应病原物入侵过程中发挥重要作用。其中，MAPKKK类激酶主要分为MEKK-like和Raf-like两类。在该级联途径中，功能研究较清楚的是MEKK-like MAPKKKs，而Raf-like MAPKKKs功能还知之甚少。此外，大多数MAPK相关研究集中在“MAPKKK-MAPKK-MAPK”级联途径的发掘，而对下游底物及涉及的分子通路研究的还相对较少。目前对MAPK下游调控网络应答棉花黄萎病的分子机制仍不明确。
近日，棉花遗传与种质创新利用团队在国际著名学术期刊Advanced Science在线发表了题为“GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a Regulates the GhERF1b- and GhABF2-mediated Pathways to Increase Cotton Disease Resistance”的研究论文。该研究揭示了棉花GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a磷酸化途径激活乙烯响应因子GhERF1b的转录并促进PR基因表达，同时抑制ABA响应基因GhABF2 的表达调控气孔开放，进而促进棉花对黄萎病抗性的分子机制。
该研究针对团队前期发掘的抗病候选基因GhMPK9开展了系统的功能和分子网络分析。通过创制GhMPK9过量表达和RNA干扰的转基因棉花株系，发现GhMPK9 在调控棉花黄萎病抗性和棉花生长发育中均扮演关键角色。过量表达GhMPK9显著提高棉花抗病性，而沉默GhMPK9的棉花植株表现为生殖生长被严重影响，无法产生后代。磷酸化蛋白组和转录组分析发现RAF-like蛋白激酶GhRAF39_1和WRKY转录因子GhWRKY40a是GhMPK9下游底物，并通过酵母双杂交、双分子荧光互补、Pull-down、荧光素酶互补、体外磷酸化等实验证明GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a分子模块磷酸化激活关系。GhMPK9不能直接磷酸化GhWRKY40a，GhRAF39_1也不能单独磷酸化GhWRKY40a，而GhMPK9和GhRAF39_1共同孵育则可以磷酸化GhWRKY40a，表明GhRAF39_1作为GhMPK9的新型磷酸化底物介导了其对GhWRKY40a的磷酸化激活过程。黄萎病菌侵染后植株表型观察、植株病情指数统计等研究发现，沉默GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a均降低了棉花对黄萎病的抗性。基于转录组联合分析进一步发掘到乙烯响应因子GhERF1b和脱落酸响应因子GhABF2为GhWRKY40a调控的下游关键靶基因。酵母单杂、LUC/REN双荧光素酶和凝胶迁移实验均表明GhWRKY40a能够直接结合GhERF1b和GhABF2的启动子，GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a的级联磷酸化促进了GhERF1b表达但抑制GhABF2的表达。此外，沉默GhERF1b显著抑制PR基因表达进而降低棉花对黄萎病的抗性，而沉默GhABF2则通过促进气孔开放，有助于降低植株体内温度和湿度，进而提高了棉花对黄萎病的抗性。综上所述，该研究解析了GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a复合体通过调控GhERF1b介导的乙烯通路和GhABF2介导的ABA通路，促进棉花抗黄萎病的分子网络。该研究加深了对棉花抗黄萎病分子机制的理解，为培育棉花抗病新品种提供了理论基础和基因资源。
GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a-GhERF1b/GhABF2参与棉花对黄萎病抗性的工作模式图
棉花遗传与种质创新利用团队博士研究生米新月和钟山青年研究员李维希为论文共同第一作者，郭旺珍教授为论文通讯作者。张大勇副教授，青年研究员王桂林，在读研究生陈川、金暄翔、许慧娟和已毕业研究生周雪松博士等参与了部分研究工作。该研究得到科技创新2030-生物育种重大专项、国家科学自然基金项目、江苏省重点研发计划、国家资助博士后研究人员计划、江苏省卓越博士后计划、江苏现代作物生产协同创新中心等项目资助。